WO2004023131A1 - Isoelectrical focussing on immobilised ph gradients - Google Patents

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WO2004023131A1
WO2004023131A1 PCT/EP2003/009771 EP0309771W WO2004023131A1 WO 2004023131 A1 WO2004023131 A1 WO 2004023131A1 EP 0309771 W EP0309771 W EP 0309771W WO 2004023131 A1 WO2004023131 A1 WO 2004023131A1
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gradients
immobilized
ief
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Michael Cahill
Pranav Sinha
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Proteosys Ag
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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture

Definitions

  • the invention relates to a method for producing “long”, i.e.> 30 cm long, immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, and a device for isoelectric focusing consisting of an IEF chamber (isoelectric focusing chamber) and a power supplier.
  • Zone electrophoresis b) Isotachophoresis c) Isoelectric focusing
  • Zone electrophoresis involves glycine, bicine and tricine buffered sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for proteins, which is routinely used for the study of proteins (Wilkins et al. 1998).
  • Isotachophoresis uses hydrophilic matrix materials and typically shows high resolution but low loading capacity. In combination with free-flow electrophoresis, this method can be used for micro-preparative purposes (Weber and Bocek, 1998).
  • Isoelectric focusing is carried out either in liquid density gradients, in gel gradients (Righetti, 1990) or in multi-chamber devices with immobiline-based separating gel media (Righetti et al., 1997).
  • a pH gradient is formed by the formation of a concentration gradient of gel solutions with different pH values.
  • the acrylamido buffer monomers polymerize together with the arylamide matrix and are thus immobilized (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990).
  • These immobilized pH gradients (IPG) gels are poured by building up a density gradient with glycerol between the two solutions of different pH values. Since this process is diffusion-limited, the immobilizing gradients produced are typically less than 30 cm long in order to ensure a correct density gradient. Therefore, immobilized pH gradients longer than 30 cm have not been reported.
  • the longest commercially available IPGs are 24 cm long and are offered by Amersham Biosciences.
  • the aim of the invention is therefore to provide a method for producing immobilized pH gradients and a device for isoelectric focusing, which at least partially solves the disadvantages existing in the prior art.
  • This aim is achieved by the device and the methods as defined in claims 1, 9 and 17.
  • Preferred embodiments are set out in dependent claims 2 to 8, 10 to 16 and 18 to 28. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of the description.
  • the invention thus relates to a device for isoelectric focusing (IEF) with a so-called IEF chamber (chamber in which isoelectric focusing is carried out) and a power supply for providing a focusing voltage for at least one immobilized pH gradient, the device being a power supply has a maximum focusing voltage of at least 10 kV, preferably at least 20 kV, in particular at least 35 kV.
  • IEF isoelectric focusing
  • the power supply is arranged entirely in the IEF chamber.
  • This can be a power supply that supplies the voltages described above.
  • the present invention also includes those electricity suppliers that supply less than 10 kV or more than 35 kV.
  • the device has at least one pH gradient with a minimum length of 30 cm.
  • this pH gradient can preferably have a length of min. at least 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm.
  • the IEF chamber can be operated alone or in combination with the power supplier, one or more cables, at least one immobilized pH gradient and / or other components for isoelectric focusing.
  • the IEF chamber for immobilized pH gradients> 30 cm alone, as well as all conceivable combinations of this chamber with one or more further components for isoelectric focusing are hereby disclosed and made the subject of the present invention.
  • the power cables between the power supply and the IEF chamber can preferably be permanently installed, ie not removable, during the IEF.
  • the IPGs can also be surrounded by an electrically insulating material that can be solid or liquid.
  • the power supply can be coupled to the IEF chamber via at least one high-voltage-resistant cable which has a dielectric strength that is adapted to the maximum focusing voltage.
  • the power cables can be permanently installed between the power supply and the IEF chamber.
  • the electricity supplier is fully integrated in the IEF apparatus and is provided with a mechanism which switches the electricity supplier off as soon as the chamber is opened and thus ensures that no user of the apparatus is endangered by the current applied to the apparatus.
  • the apparatus can preferably have a locking means which prevents the IEF chamber from opening for a limited time, generally at least 2 minutes, after the power supply has been switched off, until has reduced any remaining high voltage to a safe level.
  • the device according to the invention is to be operated under high voltage, it is advantageous if cables are used which are suitable for the high voltage to be applied (in particular 10,000 to 30,000 volts), in particular voltage isolating, so that no dangerous voltage flashovers occur during operation.
  • the electrically conductive part of the cable can be completely isolated from the ambient air.
  • the invention further relates to a method for producing immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, the pH gradients being at least 30 cm in length.
  • the pH gradients have at least a length of 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm. Again, it should be remembered that no immobilized pH gradients longer than 30 cm have been reported. The longest commercially available IPGs are 24 cm long. Thus, the present invention does not “only” include the method for producing immobilized pH gradients with minimum lengths> 30 cm, rather the immobilized pH gradients themselves are also disclosed by the present invention and are hereby made the subject of it.
  • the density difference to build up a density gradient is at least 0.1 g / cm 3 , preferably 0.2 g / cm 3 , in particular greater than 0.2 g / cm 3 .
  • At least two buffer solutions are preferably used to generate these densities.
  • the following components or mixtures of the components are particularly suitable, for example: glycerol, cesium chloride, cesium sulfate, cesium bromide, sodium bromide, potassium bromide, sucrose.
  • polymerization initiators are continuously added to produce the pH gradients with the desired minimum lengths during the casting process via gels to be polymerized. This is preferably done by adding the polymerization initiators by means of computer-controlled applicators, in particular burettes or similar pumps.
  • solutions to be applied are preferably to be applied via gels that are still to be polymerized to understand in particular solutions containing acrylamido buffer) and the gels themselves cooled so that the pH gradients achieve the desired minimum length.
  • the temperature for starting the polymerization reaction can be increased in a controlled manner and / or polymerization initiators which can be activated after the gradient has been mixed can be used, so that the pH gradients have the desired minimum length as a result of these measures.
  • the present invention can also be used to perform isoelectric focusing (IEF) of analytes, such as. B. proteins, in at least one immobilized pH gradient, which was produced by one or more of the methods described above. It is therefore an extremely long immobilized pH gradient, the copolymerization of a preformed pH gradient into a matrix such. B. polyacrylamide or a polymer matrix with similar polymerization chemistry of monomers, similar to acrylamide and bisacrylamide.
  • the IEF is carried out under high voltages, at least 10,000 V, preferably at least 20,000 V, in particular at least 30,000 V.
  • a suitable substance is the dimethylpolysiloxane oil AK10 from Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Germany, which has insulation properties of better than 10 14 ohm cm.
  • the resolution capacity of the current state-of-the-art IPG strips and the resulting 2D-PAGE gels limit the number of proteins that can be detected. Because of this low resolution, only a similar number of proteins can be detected with less sensitive detection methods (e.g. silver staining or fluorescence staining) or with highly sensitive detection methods (e.g. radio imaging). However, if the resolution capacity of the 2D-PAGE gels is increased, a significant increase in the detection rate is achieved when using highly sensitive radio-imaging-based, fluorescence-based or mass-spectroscopy-based detection methods compared to other methods.
  • the analytes to be examined eg proteins
  • the analytes to be examined are marked, separated by 2D-PAGE and detected with a suitable detector.
  • two or more samples with different radio-isotopes or different mixtures of radio-isotopes, or different stable isotopes or fluorescent dyes or mass-different reagents are marked and separated together in a 2D-PAGE gel and then separately with suitable detectors detected.
  • a detector is required that can differentiate between the differently labeled samples on the basis of physical properties and half-lives of the labeling reagents used.
  • the immobilized pH gradients can be cut into so-called IPG strips (immobilized pH gradient strips) of any width after casting. These can then be stored until use, preferably at -20 ° C, or used directly for isoelectric focusing.
  • the sample to be analyzed, in particular proteins is then preferably introduced, ie loaded, into the IPG strips by means of active rehydration. In this process, the proteins become active during the rehydration of the dry IPG strips in a rehydration chamber, at low voltages, typically less than 1250 V.
  • the IPG strip is then often transferred to a second chamber that contains wide electrodes. The contact to the electrodes is made via conductive elements (media) (e.g.
  • the pictures show:
  • Fig. 1 2D gel of 150 g protein extract from human prostate cancer tissue focused on a 54 cm long IPG strip pH 4-8.
  • Human prostate cancer tissue was extracted and prepared for the IEF according to Vuong et al. (2000) with the modification that the proteins were not iodinated.
  • the gels were cast in a casting chamber (12 cm x 54 cm x 0.5 mm) consisting of two glass plates and a U-shaped spacer and a carrier film (Gel-Fix film, Serva, Heidelberg). For this purpose, the glass plates and spacers are carefully cleaned. The glass plate with spacer is then treated several times with Repel silanes (Amersham Biosciences, Freiburg). The gel fix film is placed on the cleaned and water-covered cover glass plate, covered with paper and the water removed with a rubber roller without air bubbles. Subsequently the plate is placed with the spacer and the chamber is provided with clamps. The gel chamber is then cooled to 4 ° C.
  • the acidic and basic solution consisting of acrylamido buffers, acrylamide, PDA (piperazine diacrylamide), KBr and TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine) are prepared according to the chamber volume.
  • APS ammonium persulfate
  • the pouring of the gels and the computer-aided calculation of the mixing ratios of the acrylamido buffers (immobiline) to produce the pH gradient are carried out using the Altland and Altland (1984) method. The following immobilin ratios in a final volume of 10 ml were used to produce a linear pH 4-8 gradient.
  • the gradient is poured with computer-controlled burettes (Desaga), burette 1 containing the acidic solution, burette 2 the basic solution and burette 3 containing 2.5% (w / v) (weight / volume) ammonium persulfate solution.
  • the gels are left to stand for 10 minutes and then polymerized at 50 ° C. for 1 hour.
  • the gel is then washed with the carrier film 4 times in 15 minutes in 1.5% glycerol and dried.
  • the gel surface is covered with a film and the basic and acidic end is marked.
  • the gel is then cut into 4 mm strips and stored at -20 ° C until use. Isoelectric focusing
  • rehydration buffer 8M urea, 2% chaps, 0.5% (v / v) IPG buffer, 20 mM DTT (dithiothreitol), some bromophenol blue
  • the rehydration was carried out over 15 h at 100 V in a special rehydration chamber under DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). The strips were then transferred to a second chamber.
  • the contact between the ends of the IPG strips and the electrodes was made using 8M urea, 2% chaps (3 - ((3-cholamidopropyl) dimethylammonium) -1-propane sulfonate) soaked filter paper strips (8M urea, 2% chaps) ,
  • Electrophoresis gel media the State of the art. J. Chromatog. B 699, 63-75.
  • Electrophoresis 19, 3094-5.

Abstract

The invention relates to a method for the production of long IPGs, in other words IPGs with a minimum length of 30 cm. The use of more than 10,000 volts over a distance of more than 30 cm for the isoelectrical focussing is also disclosed. Furthermore, a device for isoelectrical focussing, comprising a so-called IEF chamber (IsoElectrical Focussing chamber) and a power supply is also disclosed, whereby the power supply delivers voltages of = 10 kV.

Description

Isoelektrische Fokussierung auf immobilisierten pH-Gradienten Isoelectric focusing on immobilized pH gradients
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von „langen", d.h. > 30 cm Länge, immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bestehend aus einer lEF-Kammer (isoelektrische Fokus- sierungskammer) und einem Stromversorger.The invention relates to a method for producing “long”, i.e.> 30 cm long, immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, and a device for isoelectric focusing consisting of an IEF chamber (isoelectric focusing chamber) and a power supplier.
Die Verwendung von elektrophoretischen Methoden für präparative Zwecke ist eine etablierte Technik, und es existieren verschiedene Apparate für präparative und analytische Zwecke. Diese Apparate und ihre zugrunde liegenden Prinzipien können in drei Kategorien aufgeteilt werden (Andrews, 1986, Westermeier, 1977).The use of electrophoretic methods for preparative purposes is an established technique and there are various apparatuses for preparative and analytical purposes. These devices and their underlying principles can be divided into three categories (Andrews, 1986, Westermeier, 1977).
a) Zonenelektrophorese b) Isotachophorese c) Isoelektrische Fokussierunga) Zone electrophoresis b) Isotachophoresis c) Isoelectric focusing
Zonenelektrophorese beinhaltet die Glycin, Bicin und Tricin gepufferten Natriumdodecylsulfat -Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) für Proteine, die routinemäßig für die Untersuchung von Proteinen eingesetzt wird (Wilkins et al. 1998).Zone electrophoresis involves glycine, bicine and tricine buffered sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for proteins, which is routinely used for the study of proteins (Wilkins et al. 1998).
Die Isotachophorese benutzt hydrophile Matrixmaterialien und zeigt typischerweise eine hohe Auflösung, aber eine geringe Beladungskapazität. In Kombination mit Free-Flow-Elektrophorese kann diese Methode für mikropräparative Zwecke eingesetzt werden (Weber und Bocek, 1998).Isotachophoresis uses hydrophilic matrix materials and typically shows high resolution but low loading capacity. In combination with free-flow electrophoresis, this method can be used for micro-preparative purposes (Weber and Bocek, 1998).
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird entweder in flüssigen Dichtegradienten, in Gelgradienten (Righetti, 1990) oder in Mehrkammer-Geräten mit Immobiline-basierenden Trenngelmedien (Righetti et al., 1997) durchgeführt.Isoelectric focusing (IEF) is carried out either in liquid density gradients, in gel gradients (Righetti, 1990) or in multi-chamber devices with immobiline-based separating gel media (Righetti et al., 1997).
Es gibt zwei etablierte lEF-Methoden im Rahmen der Durchführung einer zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE). Die als erstes entwickelte Methode verwendet eine Vorfokussierung von Trägerampholyten (TA) an ihren isoelektrischen Punkt und eine anschließende Fokussierung von Proteinen. Die so aufgetrennten Proteine werden dann in einer zweiten Dimension in einer SDS-PAGE aufgetrennt (Klose, 1975; Klose und Kobalz, 1995; O'Farrel, 1975). Dieses System besitzt eine hervorragende Auflösung und erreicht bei der Verwendung von 46 cm TA-IEF-Gelen eine Auftrennung von über 10.000 Proteinspots pro 2D-PAGE Gel (Klose und Kobalz, 1995). Kürzlich wurden auch kommerzielle Systeme mit bis zu 60 cm TA-IEF-Gelen angeboten (www.proteomefactory.com/ct_02112.html; Stand: 28.08.2002). Dennoch besteht bei diesem System das Problem, dass die basische Region des pH-Gradienten aus dem Gel heraus wandert, bevor ein Gleichgewicht erreicht ist. Diese kathodische Instabilität wird durch Bi- carbonat-lonen verursacht, welche mit atmosphärischem Kohlendioxid im Gleichgewicht stehen (Righetti, 1990). Um Proteine im basischen pH- Bereich zu untersuchen, wird ein lEF-Experiment vor dem Erreichen des Gleichgewichts abgestoppt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Auftrennung der Proteine noch nicht komplett, aber die basische Region befindet sich noch im Gel. Diese Form der IEF (non-equilibrium pH gradient gel e- lectrophoresis, NEPHGE) ist die einzige Möglichkeit, basische Proteine in einem trägerampholyt-basierenden Gelsystem zu analysieren. Ein später entwickeltes System zur isoelektrischen Fokussierung verwendet acrylamid-ähnliche Acrylamido-Puffer Monomere (Immobiline), die eine funktionelle Puffergruppe tragen. Ein pH-Gradient wird durch die Bildung eines Konzentrationsgradienten von Gellösungen mit verschiedenen pH-Werten geformt. Nach der Bildung des Gradienten poly- merisieren die Acrylamido-Puffer-Monomere zusammen mit der Arcyla- mid-Matrix und werden somit immobilisiert (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990). Diese immobilisierten pH-Gradienten (IPG) - Gele werden gegossen, in dem man einen Dichtegradienten mit Glycerol zwischen den zwei Lösungen unterschiedlicher pH-Werte aufbaut. Da dieser Vorgang diffusionslimitiert ist, sind die hergestellten Immobilingra- dienten typischerweise weniger als 30 cm lang, um einen korrekten Dichtegradienten zu gewährleisten. Daher wurde bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang und werden von Amersham Biosciences angeboten.There are two established IEF methods for performing two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). The first method developed uses pre-focusing of carrier ampholytes (TA) to their isoelectric point and subsequent focusing of proteins. The proteins thus separated are then separated in a second dimension on an SDS-PAGE (Klose, 1975; Klose and Kobalz, 1995; O'Farrel, 1975). This system has an excellent resolution and, when using 46 cm TA-IEF gels, achieves a separation of over 10,000 protein spots per 2D-PAGE gel (Klose and Kobalz, 1995). Commercial systems with up to 60 cm TA-IEF gels have also recently been offered (www.proteomefactory.com/ct_02112.html; as of August 28, 2002). However, the problem with this system is that the basic region of the pH gradient migrates out of the gel before equilibrium is reached. This cathodic instability is caused by bicarbonate ions, which are in equilibrium with atmospheric carbon dioxide (Righetti, 1990). To investigate proteins in the basic pH range, an IEF experiment is stopped before reaching equilibrium. At this point, the separation of the proteins is not yet complete, but the basic region is still in the gel. This form of IEF (non-equilibrium pH gradient gel electrophoresis, NEPHGE) is the only way to analyze basic proteins in a carrier ampholyte-based gel system. A later developed system for isoelectric focusing uses acrylamide-like acrylamido buffer monomers (immobilins) that carry a functional buffer group. A pH gradient is formed by the formation of a concentration gradient of gel solutions with different pH values. After the gradient has been formed, the acrylamido buffer monomers polymerize together with the arylamide matrix and are thus immobilized (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990). These immobilized pH gradients (IPG) gels are poured by building up a density gradient with glycerol between the two solutions of different pH values. Since this process is diffusion-limited, the immobilizing gradients produced are typically less than 30 cm long in order to ensure a correct density gradient. Therefore, immobilized pH gradients longer than 30 cm have not been reported. The longest commercially available IPGs are 24 cm long and are offered by Amersham Biosciences.
Alle bisher entwickelten und erhältlichen Systeme zur isoelektrischen Fokussierung haben daher generell das Problem, dass sie kaum bzw. unvollständig basische Proteine auftrennen bzw. aufgrund der Limitation auf vergleichsweise kurze immobilisierte pH-Gradienten eine nicht ausreichende Auflösung aufweisen.All systems for isoelectric focusing that have been developed and available to date therefore generally have the problem that they barely or incompletely separate basic proteins or have an insufficient resolution due to the limitation to comparatively short immobilized pH gradients.
Erwünscht wäre daher ein System, in dem sämtliche Analyten, wie z.B. körpereigene Proteine, bei größtmöglicher Auflösung aufgetrennt und analysiert werden können.A system in which all analytes, e.g. The body's own proteins can be separated and analyzed with the highest possible resolution.
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bereitzustellen, welches die im Stand der Technik vorhandenen Nachteile zumindest teilweise löst. Dieses Ziel wird erreicht durch die Vorrichtung und die Verfahren, wie sie in den Ansprüchen 1 , 9 und 17 definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8, 10 bis 16 und 18 bis 28 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.The aim of the invention is therefore to provide a method for producing immobilized pH gradients and a device for isoelectric focusing, which at least partially solves the disadvantages existing in the prior art. This aim is achieved by the device and the methods as defined in claims 1, 9 and 17. Preferred embodiments are set out in dependent claims 2 to 8, 10 to 16 and 18 to 28. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of the description.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass man besonders gute isoelektrische Fokussierungen durchführen kann, d.h. isoelektrische Fokussierungen mit extrem guter Auflösung und Auftrennung, wenn hierfür hohe Spannungen, also Spannungen > 10 kV, angelegt werden.Surprisingly, it has been found that particularly good isoelectric focusing can be carried out, i.e. Isoelectric focusing with extremely good resolution and separation if high voltages, i.e. voltages> 10 kV, are applied for this.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einer sogenannten lEF-Kammer (Kammer, in der die isoelektrische Fokussierung durchgeführt wird) und einer Stromversorgung zur Bereitstellung einer Fokussierungsspannung für mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Vorrichtung eine Stromversorgung aufweist, die eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, vorzugsweise mindestens 20 kV, insbesondere mindestens 35 kV, liefert. Dies ermöglicht die Verwendung langer pH- Gradienten, insbesondere mit Längen von mehr als 30 cm, wodurch sich die erzielbare Auflösung stark verbessert.The invention thus relates to a device for isoelectric focusing (IEF) with a so-called IEF chamber (chamber in which isoelectric focusing is carried out) and a power supply for providing a focusing voltage for at least one immobilized pH gradient, the device being a power supply has a maximum focusing voltage of at least 10 kV, preferably at least 20 kV, in particular at least 35 kV. This enables the use of long pH gradients, in particular with lengths of more than 30 cm, which greatly improves the resolution that can be achieved.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Stromversorgung vollständig in der lEF-Kammer angeordnet. Dabei kann es sich um eine Stromversorgung handeln, der die weiter oben beschriebenen Spannungen liefert. Jedoch sind von der vorliegenden Erfindung auch jene Stromversorger umfasst, die weniger als 10 kV oder mehr als 35 kV liefern.In a further preferred embodiment, the power supply is arranged entirely in the IEF chamber. This can be a power supply that supplies the voltages described above. However, the present invention also includes those electricity suppliers that supply less than 10 kV or more than 35 kV.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung mindestens einen pH-Gradienten mit einer Mindestlänge von 30 cm auf. Weiterhin kann vorzugsweise dieser pH-Gradient eine Länge von min- destens 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweisen. Es sei in diesem Zusammenhang daran erinnert, dass die Bereitstellung einer lEF-Kammer für IPGs > 30 cm schon für sich alleine eine erfinderische Leistung darstellt, da diese zuvor weder vorhanden noch beschrieben war. Somit kann die lEF-Kammer alleine oder in Kombination mit dem Stromversorger, einem oder mehrerer Kabel, mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten und/oder weiterer Komponenten zur isoelektrischen Fokussierung betrieben werden. Die lEF-Kammer für immobilisierte pH-Gradienten > 30 cm alleine sowie alle denkbaren Kombinationen dieser Kammer mit einer oder mehreren weiteren Komponente(n) für die isoelektrische Fokussierung (z.B. Stromversorger, Kabel, immobilisierte pH-Gradienten, Verriegelungsmittel etc.) werden hiermit offenbart und zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemacht.In a particularly preferred embodiment, the device has at least one pH gradient with a minimum length of 30 cm. Furthermore, this pH gradient can preferably have a length of min. at least 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm. In this context, it should be recalled that the provision of an IEF chamber for IPGs> 30 cm in itself represents an inventive step, since it was neither previously available nor described. Thus, the IEF chamber can be operated alone or in combination with the power supplier, one or more cables, at least one immobilized pH gradient and / or other components for isoelectric focusing. The IEF chamber for immobilized pH gradients> 30 cm alone, as well as all conceivable combinations of this chamber with one or more further components for isoelectric focusing (e.g. power suppliers, cables, immobilized pH gradients, locking means, etc.) are hereby disclosed and made the subject of the present invention.
Die Stromkabel zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer können vorzugsweise während der IEF fest installiert, also nicht entfernbar, sein. Die IPGs können weiterhin von einem elektrisch isolierenden Material umgeben sein, das fest oder flüssig sein kann.The power cables between the power supply and the IEF chamber can preferably be permanently installed, ie not removable, during the IEF. The IPGs can also be surrounded by an electrically insulating material that can be solid or liquid.
Weiterhin kann die Stromversorgung mit der lEF-Kammer über mindestens ein hochspannungsfestes Kabel gekoppelt sein, das eine der maximalen Fokussierungsspannung angepasste Spannungsfestigkeit aufweist. Die Stromkabel können dabei zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer fest installiert sein. In einer Variante ist der Stromversorger vollständig in der lEF-Apparatur integriert und mit einem Mechanismus versehen, der den Stromversorger abschaltet, sobald die Kammer geöffnet wird und somit sicherstellt, dass kein Benutzer der Apparatur durch den an die Apparatur angelegten Strom gefährdet wird. Vorzugsweise kann die Apparatur ein Verriegelungsmittel aufweisen, das ein Öffnen der lEF-Kammer nach Abschalten der Stromversorgung für eine begrenzte Zeit, in der Regel mindestens 2 min., verhindert, bis sich eine verbleibende Hochspannung auf einen ungefährlichen Wert abgebaut hat.Furthermore, the power supply can be coupled to the IEF chamber via at least one high-voltage-resistant cable which has a dielectric strength that is adapted to the maximum focusing voltage. The power cables can be permanently installed between the power supply and the IEF chamber. In a variant, the electricity supplier is fully integrated in the IEF apparatus and is provided with a mechanism which switches the electricity supplier off as soon as the chamber is opened and thus ensures that no user of the apparatus is endangered by the current applied to the apparatus. The apparatus can preferably have a locking means which prevents the IEF chamber from opening for a limited time, generally at least 2 minutes, after the power supply has been switched off, until has reduced any remaining high voltage to a safe level.
Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung unter Hochspannung betrieben werden soll ist es vorteilhaft, wenn Kabel verwendet werden, die für die anzulegende Hochspannung ( insbesondere 10.000 bis 30.000 Volt) geeignet, insbesondere spannungsisolierend sind, so dass bei der Bedienung keine gefährlichen Spannungsüberschläge auftreten. Dabei kann der stromleitende Teil der Kabel vollständig von der Umgebungsluft isoliert sein.If the device according to the invention is to be operated under high voltage, it is advantageous if cables are used which are suitable for the high voltage to be applied (in particular 10,000 to 30,000 volts), in particular voltage isolating, so that no dangerous voltage flashovers occur during operation. The electrically conductive part of the cable can be completely isolated from the ambient air.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, wobei die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 30 cm aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die pH- Gradienten mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, auf. Erneut sei daran erinnert, dass bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet wurde. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang. Somit umfasst die vorliegende Erfindung nicht „nur" das Verfahren zur Herstellung immobilisierter pH-Gradienten mit Mindestlängen > 30 cm, vielmehr sind auch die immobilisierten pH- Gradienten selbst durch die vorliegende Erfindung offenbart und werden hiermit zu deren Gegenstand gemacht.The invention further relates to a method for producing immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, the pH gradients being at least 30 cm in length. In a preferred embodiment, the pH gradients have at least a length of 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm. Again, it should be remembered that no immobilized pH gradients longer than 30 cm have been reported. The longest commercially available IPGs are 24 cm long. Thus, the present invention does not “only” include the method for producing immobilized pH gradients with minimum lengths> 30 cm, rather the immobilized pH gradients themselves are also disclosed by the present invention and are hereby made the subject of it.
Mit 'der vorliegenden Erfindung können lange bis extrem lange IPGs hergestellt werden. Dabei ist eine charakteristische Eigenschaft dieser IPGs, dass diese immobilisierten pH-Gradienten über 30 cm lang sind, vorzugsweise bis ca. 100 cm oder mehr. Die Herstellung solch langer Gradienten ist schwierig. So ist, um einen gleichmäßig langen Gradienten zu erstellen, eine langsame, pulsationsfreie Flussrate der einzelnen, mindestens zwei, Pufferkomponenten beim Gießvorgang zu gewährleis- ten. Dieser Vorgang kann mit Hilfe von z. B. computergesteuerten "Kol- benbüretten" oder ähnlichen Pumpen ermöglicht werden. Um die langsamen Flussraten zu gewährleisten, ist eine Kontrolle der Polymerisationsgeschwindigkeit unerlässlich. Diese wird z.B. gewährleistet durch die kontinuierliche computergesteuerte Zugabe von Polymerisationsinitiatoren (wie z. B. Ammoniumperoxosulfat) während des Gießvorgangs oder durch eine Kühlung der Pufferlösungen und des gegossenen Gradienten und eine anschließende kontrollierte Temperaturerhöhung zum Starten der Polymerisation oder durch die Verwendung von nach der Mischung des Gradienten aktivierbaren Polymerisationsinitiatoren (z. B. UV-Licht induzierbar wie z. B. Riboflavin oder Methylenblau, Rabilloud et al., 1996b und darin enthaltene Referenzen) oder durch eine Kombination der vorher genannten Methoden. Für die Generation eines Dichtegradienten zur Herstellung von langen Gelen eignen sich bevorzugt schwere Pufferlösungen mit einer Dichte größer als 1 ,1. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Dichtedifferenz zum Aufbau eines Dichtegradienten mindestens 0,1 g/cm3, vorzugsweise 0,2 g/cm3, insbesondere größer als 0,2 g/cm3. Zur Generation dieser Dichten werden vorzugsweise mindestens zwei Pufferlösungen verwendet. Besonders geeignet sind beispielsweise folgende Komponenten oder Gemische der Komponenten: Glycerin, Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat, Cäsi- umbromid, Natriumbromid, Kaliumbromid, Saccharose.With the present invention long to extremely long IPGs can be produced. It is a characteristic property of these IPGs that these immobilized pH gradients are over 30 cm long, preferably up to about 100 cm or more. It is difficult to create such long gradients. In order to create a uniformly long gradient, a slow, pulsation-free flow rate of the individual, at least two, buffer components must be guaranteed during the casting process. ten. This process can be done with the help of z. B. computer-controlled "piston burettes" or similar pumps. To ensure slow flow rates, it is essential to control the rate of polymerization. This is ensured, for example, by the continuous computer-controlled addition of polymerization initiators (such as ammonium peroxosulfate) during the pouring process or by cooling the buffer solutions and the poured gradient and a subsequent controlled temperature increase to start the polymerization or by using after mixing the Gradient-activatable polymerization initiators (for example UV-inducible such as for example riboflavin or methylene blue, Rabilloud et al., 1996b and references contained therein) or by a combination of the aforementioned methods. For the generation of a density gradient for the production of long gels, heavy buffer solutions with a density greater than 1.1 are preferred. In a preferred embodiment of the invention, the density difference to build up a density gradient is at least 0.1 g / cm 3 , preferably 0.2 g / cm 3 , in particular greater than 0.2 g / cm 3 . At least two buffer solutions are preferably used to generate these densities. The following components or mixtures of the components are particularly suitable, for example: glycerol, cesium chloride, cesium sulfate, cesium bromide, sodium bromide, potassium bromide, sucrose.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung der pH- Gradienten mit den gewünschten Mindestlängen während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren zugegeben. Dies erfolgt vorzugsweise durch die Zugabe der Polymerisationsinitiatoren mittels computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten oder ähnliche Pumpen.In a preferred embodiment, polymerization initiators are continuously added to produce the pH gradients with the desired minimum lengths during the casting process via gels to be polymerized. This is preferably done by adding the polymerization initiators by means of computer-controlled applicators, in particular burettes or similar pumps.
Vorzugsweise werden während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele zu applizierende Lösungen (unter Lösungen sind insbesondere Acrylamidopuffer enthaltende Lösungen zu verstehen) und die Gele selbst gekühlt, so dass die pH-Gradienten die gewünschte Mindestlänge erlangen. Nach der Kühlung der Lösungen und der Gele kann erfindungsgemäß weiterhin die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion kontrolliert erhöht werden und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren verwendet werden, so dass durch diese Maßnahmen die pH-Gradienten die erwünschte Mindestlänge aufweisen.During the casting process, solutions to be applied (gels are to be applied) are preferably to be applied via gels that are still to be polymerized to understand in particular solutions containing acrylamido buffer) and the gels themselves cooled so that the pH gradients achieve the desired minimum length. After cooling the solutions and the gels, according to the invention the temperature for starting the polymerization reaction can be increased in a controlled manner and / or polymerization initiators which can be activated after the gradient has been mixed can be used, so that the pH gradients have the desired minimum length as a result of these measures.
Die vorliegende Erfindung kann weiterhin dazu benutzt werden, isoelektrischen Fokussierungen (IEF) von Analyten, wie z. B. Proteinen, in mindestens einem immobilisierten pH-Gradienten vorzunehmen, der durch eines oder mehrerer der weiter oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Es handelt sich damit um einen extrem langen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Copolymerisation eines vorgeformten pH-Gradienten in eine Matrix wie z. B. Polyacrylamid oder einer Polymermatrix mit ähnlicher Polymerisationschemie von Monomeren, ähnlich zu Acrylamid und Bisacrylamid, erfolgt. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird die IEF unter hohen Voltzahlen, mindestens 10.000 V, vorzugsweise mindestens 20.000 V, insbesondere mindestens 30.000 V, durchgeführt. Derart hohe Voltzahlen wurden bisher von Experten vermieden, weil man befürchtete, dass die Entstehung von Entladungsfunken und die Hitzeentwicklung den isoelektrischen Fokus- siervorgang stören könnte und wegen der potentiellen Gefahr für Mitarbeiter. Hieraus folgte aber, dass die Fokussierzeit für z. B. 54 cm IPG- Stre*ifen pH 4-8 bei 10.000 V 75 Stunden dauert; in Gegensatz zu weniger als 37 Stunden bei einer Voltzahl von 20.000 V, und 25 Stunden bei einer Voltzahl von 30.000 V. Daher stellt die Anwendung von hohen Voltzahlen während der IEF von langen IPGs eine erfinderische Leistung dar, die den Durchsatz stark erhöht und darüber hinaus die Spotgröße der an ihrem isoelektrischen Punkt (pl) fokussierten Proteine verkleinert. Die hohen Voltzahlen werden durch die Verwendung eines e- lektrisch isolierenden Mediums, insbesondere eines Öls, ermöglicht, das die Elektroden und die IPG-Streifen während der IEF umgibt.The present invention can also be used to perform isoelectric focusing (IEF) of analytes, such as. B. proteins, in at least one immobilized pH gradient, which was produced by one or more of the methods described above. It is therefore an extremely long immobilized pH gradient, the copolymerization of a preformed pH gradient into a matrix such. B. polyacrylamide or a polymer matrix with similar polymerization chemistry of monomers, similar to acrylamide and bisacrylamide. In a preferred variant of the invention, the IEF is carried out under high voltages, at least 10,000 V, preferably at least 20,000 V, in particular at least 30,000 V. Such high voltages have so far been avoided by experts because it was feared that the generation of discharge sparks and the development of heat could interfere with the isoelectric focusing process and because of the potential danger to employees. From this it followed, however, that the focusing time for e.g. B. 54 cm IPG Stre * ifen pH lasts at 10,000 V 75 hours 4-8; as opposed to less than 37 hours at 20,000 V and 25 hours at 30,000 V. Therefore, using high voltages during IEF of long IPGs is an inventive feat that greatly increases throughput and beyond the spot size of the proteins focused at their isoelectric point (pl) is reduced. The high voltages are achieved by using an e- electrically insulating medium, in particular an oil, that surrounds the electrodes and the IPG strips during the IEF.
Eine geeignete Substanz ist das Dimethylpolysiloxanöl AK10 der Firma Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Deutschland, das Isolationseigenschaften von besser als 1014 Ohm cm aufweist.A suitable substance is the dimethylpolysiloxane oil AK10 from Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Germany, which has insulation properties of better than 10 14 ohm cm.
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft herausgestellt, wenn die immobilisierten pH-Gradienten unter einer Ölschicht oder einer ähnlichen organischen/elektrisch isolierenden Schicht fokussiert werden, da die immobilisierten pH-Gradientengele ansonsten über die Zeit langsam durch Wasserverlust an die Atmosphäre austrocknen würden.It has proven to be advantageous in practice if the immobilized pH gradients are focused under an oil layer or a similar organic / electrically insulating layer, since the immobilized pH gradient gels would otherwise dry out slowly over time due to water loss to the atmosphere.
Die Auflösungskapazität von dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden IPG-Streifen und die resultierenden 2D-PAGE Gele limitieren die Anzahl der Proteine, die detektiert werden können. Aufgrund dieser geringen Auflösung können mit wenig sensitiven Detektions- methoden (z. B. Silberfärbung oder Fluoreszenzfärbung) oder mit hochsensitiven Detektionsmethoden (z .B. Radio-Imaging) nur eine ähnliche Anzahl an Proteinen detektiert werden. Wenn jedoch die Auflösungskapazität der 2D-PAGE Gele erhöht wird, erzielt man bei der Verwendung von hochsensitiven Radio-Imaging basierenden, fluoreszenz-basieren- den oder massenspektroskopie-basierenden Detektionsverfahren im Vergleich zu anderen Methoden eine signifikante Steigerung der Detek- tionsrate. In diesem Zusammenhang ist es vorteilhaft, wenn mindestens zwe'i verschiedene Proben mit unterschiedlichen Radioisotopen und/ oder verschiedenen Gemischen von Radioisotopen und/oder mindestens zwei Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und/ o- der verschiedener Gemische von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen stabilen Isotopen und/oder verschiedenen Gemischen von stabilen Isotopen und/ o- der mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen mas- sendifferenten Reagenzien markiert werden.The resolution capacity of the current state-of-the-art IPG strips and the resulting 2D-PAGE gels limit the number of proteins that can be detected. Because of this low resolution, only a similar number of proteins can be detected with less sensitive detection methods (e.g. silver staining or fluorescence staining) or with highly sensitive detection methods (e.g. radio imaging). However, if the resolution capacity of the 2D-PAGE gels is increased, a significant increase in the detection rate is achieved when using highly sensitive radio-imaging-based, fluorescence-based or mass-spectroscopy-based detection methods compared to other methods. In this context it is advantageous if at least two different samples with different radioisotopes and / or different mixtures of radioisotopes and / or at least two samples with different fluorescent dyes and / or different mixtures of fluorescent dyes and / or at least two different samples are included different stable isotopes and / or different mixtures of stable isotopes and / o- of which at least two different samples are labeled with different mass-different reagents.
In diesen bevorzugten Darstellungen der Erfindung sind die zu untersuchenden Analyten (z. B. Proteine), insbesondere mit Radioisotopen, stabilen Isotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien, markiert, durch 2D-PAGE aufgetrennt und mit einem geeigneten Detektor detektiert. In dieser besonders bevorzugten Variante der Erfindung werden zwei oder mehr Proben mit unterschiedlichen Radio-Isotopen oder verschiedenen Gemischen von Radio-Isotopen, oder verschiedenen stabilen Isotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien markiert und in einem 2D-PAGE Gel zusammen aufgetrennt und anschließend separat mit geeigneten Detektoren detektiert. Dieses ermöglicht die Erstellung von Gelbildern, der einzelnen ursprünglichen markierten Proben. Für diese besondere Art der Analyse wird ein Detektor benötigt, der auf der Basis von physikalischen Eigenschaften und Halbwertszeiten der verwendeten Markierungsreagenzien zwischen den unterschiedlich markierten Proben unterscheiden kann.In these preferred representations of the invention, the analytes to be examined (eg proteins), in particular with radioisotopes, stable isotopes, fluorescent dyes or mass-different reagents, are marked, separated by 2D-PAGE and detected with a suitable detector. In this particularly preferred variant of the invention, two or more samples with different radio-isotopes or different mixtures of radio-isotopes, or different stable isotopes or fluorescent dyes or mass-different reagents are marked and separated together in a 2D-PAGE gel and then separately with suitable detectors detected. This enables the creation of gel images of the individual originally marked samples. For this special type of analysis, a detector is required that can differentiate between the differently labeled samples on the basis of physical properties and half-lives of the labeling reagents used.
Die immobilisierten pH-Gradienten können erfindungsgemäß nach dem Gießen in sogenannte IPG-Streifen (immobilisierte pH-Gradienten- Streifen) beliebiger Breite geschnitten werden. Diese können dann bis zur Verwendung gelagert, vorzugsweise bei -20°C, oder direkt für die isoelektrische Fokussierung verwendet werden. Die zu analysierende Probe, insbesondere Proteine, werden dann vorzugsweise mittels aktiver' Rehydratation in die IPG-Streifen eingebracht, d.h. beladen. In diesem Prozess werden die Proteine aktiv, während der Rehydratation der trockenen IPG-Streifen in einer Rehydratationskammer, bei geringer Voltzahl, typischerweise weniger als 1250 V, eingebracht. Der IPG- Streifen wird dann häufig in eine zweite Kammer transferiert, die weite Elektroden enthält. Der Kontakt zu den Elektroden wird über leitende Elemente (Medien) (z. B. Wasser enthaltende und/oder mit wässrigen, Chemikalien enthaltende Lösungen getränkte Filterpapierstreifen) an beiden Enden der IPG-Streifen hergestellt. Die Filterpapierstreifen werden in zeitlichen Intervallen während der IEF mindestens einmal ausgetauscht, um im Filterpapier akkumulierende Ionen zu entfernen. Die Entfernung dieser im Filterpapier akkumulierenden Ionen ist für hochwertige Resultate besonders vorteilhaft.According to the invention, the immobilized pH gradients can be cut into so-called IPG strips (immobilized pH gradient strips) of any width after casting. These can then be stored until use, preferably at -20 ° C, or used directly for isoelectric focusing. The sample to be analyzed, in particular proteins, is then preferably introduced, ie loaded, into the IPG strips by means of active rehydration. In this process, the proteins become active during the rehydration of the dry IPG strips in a rehydration chamber, at low voltages, typically less than 1250 V. The IPG strip is then often transferred to a second chamber that contains wide electrodes. The contact to the electrodes is made via conductive elements (media) (e.g. water-containing and / or with aqueous, Solutions containing chemical impregnated filter paper strips) on both ends of the IPG strips. The filter paper strips are replaced at least once during the IEF in order to remove ions accumulating in the filter paper. The removal of these ions accumulating in the filter paper is particularly advantageous for high-quality results.
Schließlich ist von Vorteil, wenn die Temperatur während der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird, um die Reproduzierbarkeit der IEF zu verbessern. Maximale Temperaturschwankungen von +/- 5 °C, insbesondere von +/- 2 °C, sind hierbei bevorzugt.Finally, it is advantageous if the temperature is kept almost constant during isoelectric focusing in order to improve the reproducibility of the IEF. Maximum temperature fluctuations of +/- 5 ° C, in particular +/- 2 ° C, are preferred.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die isoelektrische Fokussierung in langen bis extrem langen immobilisierten pH-Gradienten (> 30 cm Länge) insbesondere durch eine Kombination der nachfolgend beschriebenen verschiedenen Faktoren ermöglicht wurde:In summary, it can be said that isoelectric focusing in long to extremely long immobilized pH gradients (> 30 cm in length) was made possible in particular by a combination of the various factors described below:
a. Die Verwendung computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten, zur reproduzierbaren Herstellung der pH-Gradienten. b. Die Verwendung einer elektrisch isolierenden Schicht, insbesondere einer Ölschicht, während der Fokussierung, so dass die Austrocknung der Gele an der Atmosphäre verhindert werden kann. c. Die Verwendung von sehr hohen Spannungen während der Fo- kussierungsprozedur.a. The use of computer-controlled applicators, especially burettes, for the reproducible production of the pH gradient. b. The use of an electrically insulating layer, in particular an oil layer, during focusing, so that drying out of the gels in the atmosphere can be prevented. c. The use of very high voltages during the focusing procedure.
Diese Methoden stellen eine wertvolle Erweiterung der bisher bestehenden Möglichkeiten zur Untersuchung komplexer Zusammenhänge, wie sie z.B. in der Proteomforschung vorliegen, dar, so dass Wissenschafter bzw. Forschungsunternehmen sowie alle auf diesem oder anderer Gebiete tätigen mit Hilfe der vorliegenden Erfindung in die Lage versetzt werden, Zusammenhänge aufzuklären und neue Erkenntnisse zu gewinnen. Die bestehenden Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und der Figur. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.These methods represent a valuable extension of the previously available possibilities for the investigation of complex relationships, such as exist in proteome research, so that scientists or research companies as well as all those working in this or other fields are enabled with the help of the present invention to Clarify relationships and gain new knowledge. The existing features and further features of the invention result from the following description of preferred embodiments in conjunction with the subclaims and the figure. The individual features can be implemented individually or in combination with one another.
In den Abbildungen zeigen:The pictures show:
Fig. 1 : 2D-Gel von 150 g Proteinextrakt aus menschlichem Prostatakrebsgewebe fokussiert auf einem 54 cm langen IPG- Streifen pH 4-8.Fig. 1: 2D gel of 150 g protein extract from human prostate cancer tissue focused on a 54 cm long IPG strip pH 4-8.
Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.The following example serves to explain the invention in more detail.
Material und Methoden:Material and methods:
Menschliches Prostatakrebsgewebe wurde extrahiert und für die IEF vorbereitet nach Vuong et al. (2000) mit der Modifikation, dass die Proteine nicht jodiert wurden.Human prostate cancer tissue was extracted and prepared for the IEF according to Vuong et al. (2000) with the modification that the proteins were not iodinated.
Herstellung von 54 cm langen IPG-GelenManufacture of 54 cm long IPG gels
Die Gele wurden in einer Gießkammer (12 cm x 54 cm x 0,5 mm) bestehend aus zwei Glasplatten und einem U-förmigen Abstandhalter und einer Trägerfolie (Gel-Fix Folie, Serva, Heidelberg) gegossen. Die Glasplatten und Spacer werden hierzu sorgfältig gereinigt. Die Glasplatte mit Spacer wird anschließend mehrfach mit Repel-Silane (Amersham Bio- sciences, Freiburg) behandelt. Die Gel-Fixfolie wird auf die gereinigte und mit Wasser bedeckte Deckglasplatte gelegt, mit Papier bedeckt und mit einer Gummiwalze das Wasser luftblasenfrei entfernt. Anschließend wird die Platte mit dem Abstandhalter aufgesetzt und die Kammer mit Klemmen versehen. Die Gelkammer wird dann auf 4 °C gekühlt. Zur Vorbereitung der Gellösungen werden gemäß Kammervolumen die saure und basische Lösung bestehend aus Acrylamido-puffern, Acrylamid, PDA (Piperazin-diacrylamid), KBr und TEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin) vorbereitet. APS (Ammoniumpersulfat) wird später während der Gradientenherstellung kontrolliert zugesetzt. Das Gießen der Gele und die computergestützte Berechnung der Mischungsverhältnisse der Acrylamidopuffer (Immobiline) zur Herstellung des pH-Gradienten erfolgt nach der Methode von Altland und Altland (1984). Für die Herstellung eines linearen pH 4-8 Gradienten wurden folgende Immobilin- Verhältnisse in einem Endvolumen von 10 ml verwendet.The gels were cast in a casting chamber (12 cm x 54 cm x 0.5 mm) consisting of two glass plates and a U-shaped spacer and a carrier film (Gel-Fix film, Serva, Heidelberg). For this purpose, the glass plates and spacers are carefully cleaned. The glass plate with spacer is then treated several times with Repel silanes (Amersham Biosciences, Freiburg). The gel fix film is placed on the cleaned and water-covered cover glass plate, covered with paper and the water removed with a rubber roller without air bubbles. Subsequently the plate is placed with the spacer and the chamber is provided with clamps. The gel chamber is then cooled to 4 ° C. To prepare the gel solutions, the acidic and basic solution consisting of acrylamido buffers, acrylamide, PDA (piperazine diacrylamide), KBr and TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine) are prepared according to the chamber volume. APS (ammonium persulfate) is added in a controlled manner later during the gradient production. The pouring of the gels and the computer-aided calculation of the mixing ratios of the acrylamido buffers (immobiline) to produce the pH gradient are carried out using the Altland and Altland (1984) method. The following immobilin ratios in a final volume of 10 ml were used to produce a linear pH 4-8 gradient.
Saure Lösung Basische LösungAcidic solution Basic solution
Immobiline pK 3,6 392,5 l 0,0 lImmobiline pK 3.6 392.5 l 0.0 l
Immobiline pK 4,6 169 l 369,2 μ\Immobiline pK 4.6 169 l 369.2 μ \
Immobiline pK 6,2 156,8 l 239,6 μ\Immobiline pK 6.2 156.8 l 239.6 μ \
Immobiline pK 7,0 78,2 /l 94,7 μlImmobiline pK 7.0 78.2 / l 94.7 ul
Immobiline pK 8,5 113,04 l 222,7 μlImmobiline pK 8.5 113.04 l 222.7 ul
Der Gradient wird mit computergesteuerten Büretten (Desaga) gegossen, wobei Bürette 1 die saure Lösung, Bürette 2 die basische Lösung und Bürette 3 die 2,5 % (w/v) (Gewicht/Volumen) Ammoniumpersulfatlösung enthält. Die Gele werden nach dem Gießen für 10 min stehen gelassen und dann 1 h bei 50 °C auspolymerisiert. Anschließend wird das Gel' mit der Trägerfolie 4 mal 15 Minuten in 1 ,5 % Glycerol gewaschen und getrocknet. Die Geloberfläche wird mit einer Folie abgedeckt und das basische und saure Ende markiert. Anschließend wird das Gel in 4 mm breite Streifen geschnitten und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Isoelektrische FokussierungThe gradient is poured with computer-controlled burettes (Desaga), burette 1 containing the acidic solution, burette 2 the basic solution and burette 3 containing 2.5% (w / v) (weight / volume) ammonium persulfate solution. After casting, the gels are left to stand for 10 minutes and then polymerized at 50 ° C. for 1 hour. The gel 'is then washed with the carrier film 4 times in 15 minutes in 1.5% glycerol and dried. The gel surface is covered with a film and the basic and acidic end is marked. The gel is then cut into 4 mm strips and stored at -20 ° C until use. Isoelectric focusing
150 μg Protein in 1200 μl Rehydratisierungspuffer (8M Harnstoff, 2 % Chaps, 0,5 % (v/v) IPG Puffer, 20 mM DTT (Dithiothreitol), etwas Bromphenolblau) werden zur Rehydratation der IPG-Streifen verwendet. Die Rehydratation erfolgte über 15 h bei 100 V in einer speziellen Rehydratationskammer unter DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). Anschließend wurden die Streifen in eine zweite Kammer überführt. Hier wurde der Kontakt zwischen den Enden der IPG-Streifen und der Elektroden mittels 8M Harnstoff, 2 % Chaps (3-((3-Cholamidopro- pyl)dimethylammonium)-1 -propansulfonat) getränkten Filterpapierstreifen (8M Harnstoff, 2 % Chaps) hergestellt.150 μg protein in 1200 μl rehydration buffer (8M urea, 2% chaps, 0.5% (v / v) IPG buffer, 20 mM DTT (dithiothreitol), some bromophenol blue) are used to rehydrate the IPG strips. The rehydration was carried out over 15 h at 100 V in a special rehydration chamber under DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). The strips were then transferred to a second chamber. Here, the contact between the ends of the IPG strips and the electrodes was made using 8M urea, 2% chaps (3 - ((3-cholamidopropyl) dimethylammonium) -1-propane sulfonate) soaked filter paper strips (8M urea, 2% chaps) ,
Zur Fokussierung der Proben wurde folgendes Programm verwendet:The following program was used to focus the samples:
500 V 1 Stunde500 V 1 hour
1250 V 1 Stunde1250 V 1 hour
2500V 30 Minuten2500V 30 minutes
20.000V bis 125.000 Voltstunden20,000V to 125,000 volt hours
Diese Filterpapierstreifen wurden dann nach den ersten drei Fokussie- rungsschritten gewechselt. Die Ströme wurden limitiert auf 60 Mikroampere je IPG-Streifen. Bei anderen Versuchen wurden Spannungen bis zu 35.000 Volt unter ähnlichen Bedingungen angewendet.These filter paper strips were then changed after the first three focusing steps. The currents were limited to 60 microamps per IPG strip. In other experiments, voltages up to 35,000 volts were used under similar conditions.
Nach der Fokussierung wurden die 54 cm Streifen in 3 x 18 cm Streifen zerschnitten und in der zweiten Dimension (2D-SDS-PAGE) aufgetrennt, wie bei Vuong et al. (2000) beschrieben. Die Färbung der Gele mittels Silber er olgte nach Heukeshoven und Dernick (1988). LITERATUR:After focusing, the 54 cm strips were cut into 3 x 18 cm strips and separated in the second dimension (2D-SDS-PAGE), as described by Vuong et al. (2000). The gels were stained with silver according to Heukeshoven and Dernick (1988). LITERATURE:
Altland, K und Altand, A. (1984). Pouring reproducible gradients in gels under Computer control: new devices for simultaneous delivery of two independent gradients, for more felxible slope and pH ränge of immobi- lized pH gradients. Clinical Chemistry 30, 2098-2103Altland, K and Altand, A. (1984). Pouring reproducible gradients in gels under Computer control: new devices for simultaneous delivery of two independent gradients, for more flexible slope and pH ranges of immobilized pH gradients. Clinical Chemistry 30, 2098-2103
Andrews, A. T. (1986). Electrophoresis : Theory, Techniques, and Bio- chemical and Clinical Applications, 2nd Ed. (Dec 1986) Edition: Oxford University Press).Andrews, A.T. (1986). Electrophoresis: Theory, Techniques, and Bio-chemical and Clinical Applications, 2nd Ed. (Dec 1986) Edition: Oxford University Press).
Gorg, A., Obermaier, C, Boguth, G., Härder, A., Scheibe, B., Wildgru- ber, R., and Weiss, W. (2000). The current State of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 21 , 1037-53.Gorg, A., Obermaier, C, Boguth, G., Härder, A., Scheibe, B., Wildgruber, R., and Weiss, W. (2000). The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 21, 1037-53.
Görg, A., Postel, W., and Günther, S. (1988). The current State of two dimensional electrophoresis with immobilised pH gradients. Electrophoresis 9, 531 -546.Görg, A., Postel, W., and Günther, S. (1988). The current state of two dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9, 531 -546.
Hansen, J. N. (1976). Electrophoresis of ribonucleic acid on a poly- acrylamide gel which contains disulfide cross-linkages. Anal Biochem 76, 37-44.Hansen, J.N. (1976). Electrophoresis of ribonucleic acid on a poly-acrylamide gel which contains disulfide cross-linkages. Anal Biochem 76, 37-44.
Heukeshoven, J., and Dernick, R. (1988). Improved silver staining pro- cedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 9, 28-32.Heukeshoven, J., and Dernick, R. (1988). Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 9, 28-32.
Klose, J. (1975). Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for in- duced point mutations in mammals. Humangenetik 26, 231 -43. Klose, J., and Kobalz, U. (1995). Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16, 1034-1059.Klose, J. (1975). Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Human Genetics 26, 231-43. Klose, J., and Kobalz, U. (1995). Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16, 1034-1059.
Lyubimova, T., Caglio, S., Gelfi, C, Righetti, P. G., and Rabilloud, T. (1993). Photopolymerization of polyacrylamide gels with methylene blue. Electrophoresis 14, 40-50.Lyubimova, T., Caglio, S., Gelfi, C, Righetti, P.G., and Rabilloud, T. (1993). Photopolymerization of polyacrylamide gels with methylene blue. Electrophoresis 14, 40-50.
O'Farrell, P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250, 4007-21.O'Farrell, P.H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250, 4007-21.
Rabilloud, T. (1996). Solubilization of proteins for electrophoretic analy- ses. Electrophoresis 17, 813-29.Rabilloud, T. (1996). Solubilization of proteins for electrophoretic analyzes. Electrophoresis 17, 813-29.
Rabilloud, T., Valerie G, Lawrence J. J. (1996b). One- and two- dimensional histone separations in acidic gels: Usefulness of methylene blue-driven photopolymerization. Electrophoresis 17, 67-73.Rabilloud, T., Valerie G, Lawrence J.J. (1996b). One- and two-dimensional histone separations in acidic gels: Usefulness of methylene blue-driven photopolymerization. Electrophoresis 17, 67-73.
Righetti, P. G. (1990). Immobilised pH gradients: theory and methodol- ogy. In Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, R. H. Burdon and P. H. Knippenberg, eds. (Amsterdam: Elsevier), pp. 397.Righetti, P.G. (1990). Immobilized pH gradients: theory and methodological. In Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, R.H. Burdon and P.H. Knippenberg, eds. (Amsterdam: Elsevier), pp. 397th
Righetti, P. G., Bossi, A., Wenisch, E., and Orsini, G. (1997). Protein pu- rification in multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes. J Chromatogr B Biomed Sei Appl 699, 105-15.Righetti, P.G., Bossi, A., Wenisch, E., and Orsini, G. (1997). Protein purification in multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes. J Chromatogr B Biomed Be Appl 699, 105-15.
Righetti, P. G., and Gelfi, C. (1996). Electrophoresis gel media: the State of the art. J. Chromatog. B 699, 63-75.Righetti, P.G., and Gelfi, C. (1996). Electrophoresis gel media: the State of the art. J. Chromatog. B 699, 63-75.
Vuong GL, Weiss SM, Kammer W, Priemer M, Vingron M, Nordheim A, Cahill MA. (2000). Improved sensitivity proteomics by postharvest alkyla- tion and radioactive labelling of proteins. Electrophoresis. 21 , 2594-605. Weber, G., and Bocek, P. (1998). Stability of continuous flow electrophoresis [In Process Citation]. Electrophoresis 19, 3094-5.Vuong GL, Weiss SM, Kammer W, Priemer M, Vingron M, Nordheim A, Cahill MA. (2000). Improved sensitivity proteomics by postharvest alkylation and radioactive labeling of proteins. Electrophoresis. 21, 2594-605. Weber, G., and Bocek, P. (1998). Stability of continuous flow electrophoresis [In Process Citation]. Electrophoresis 19, 3094-5.
Westermeier, R. (1977). Electrophoresis in Practice : A Guide to Methode and Applications of DNA and Protein Separations, 2n Edition (Wein- hem: John Wiley and Sons).Westermeier, R. (1977). Electrophoresis in Practice: A Guide to Method and Applications of DNA and Protein Separations, 2n Edition (Weinhem: John Wiley and Sons).
Wilkins, M. R., Gasteiger, E., Sanchez, J. C, Bairoch, A., and Hochstrasser, D. F. (1998). Two-dimensional gel electrophoresis for pro- teome projects: the effects of protein hydrophobicity and copy number. Electrophoresis 19, 1501-5. Wilkins, M.R., Gasteiger, E., Sanchez, J.C. Bairoch, A., and Hochstrasser, D.F. (1998). Two-dimensional gel electrophoresis for project projects: the effects of protein hydrophobicity and copy number. Electrophoresis 19, 1501-5.

Claims

Patentansprüche claims
1. Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einer sogenannten lEF-Kammer und einer Stromversorgung zur Bereitstellung einer Fokussierungsspannung für mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, vorzugsweise mindestens 20 kV, insbesondere mindestens 35 kV, liefert.1. Device for isoelectric focusing (IEF) with a so-called IEF chamber and a power supply for providing a focusing voltage for at least one immobilized pH gradient, characterized in that the power supply has a maximum focusing voltage of at least 10 kV, preferably at least 20 kV, in particular delivers at least 35 kV.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung vollständig in der lEF-Kammer angeordnet ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the power supply is arranged entirely in the IEF chamber.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen pH-Gradienten mit einer Mindestlänge von 30 cm aufweist.3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that it has at least one pH gradient with a minimum length of 30 cm.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Gradient mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweist.4. The device according to claim 3, characterized in that the pH gradient has at least a length of 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung mit der lEF-Kammer über mindestens ein hochspannungsfestes Kabel gekoppelt ist, das eine der maximalen Fokussierungsspannung angepasste Spannungsfestigkeit aufweist.5. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the power supply is coupled to the IEF chamber via at least one high-voltage-resistant cable which has a dielectric strength adapted to the maximum focusing voltage.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromkabel zwischen Stromversorgung und lEF-Kammer fest installiert sind. 6. The device according to claim 5, characterized in that the power cables between the power supply and IEF chamber are permanently installed.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lEF-Kammer eine Sicherungseinrichtung aufweist, die bei Öffnung der lEF-Kammer die Stromversorgung ausschaltet.7. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the IEF chamber has a safety device which switches off the power supply when the IEF chamber opens.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Verriegelungsmittel aufweist, das ein Öffnen der lEF-Kammer nach Abschalten der Stromversorgung verhindert, bis sich eine verbleibende Hochspannung auf einen ungefährlichen Wert abgebaut hat.8. Device according to one of the preceding claims, characterized in that it has a locking means which prevents opening of the IEF chamber after switching off the power supply until a remaining high voltage has reduced to a non-hazardous value.
9. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 30 cm aufweisen.9. A method for producing immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, characterized in that the pH gradients have a length of at least 30 cm.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweisen.10. The method according to claim 9, characterized in that the pH gradients have at least a length of 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Dichtegradient mit einer Dichtedifferenz von mindestens 0,1 g/cm3, vorzugsweise mindestens 0,2 g/cm3, insbesondere größer 0,2 g/cm3, aufgebaut wird.11. The method according to claim 9 or 10, characterized in that a density gradient with a density difference of at least 0.1 g / cm 3 , preferably at least 0.2 g / cm 3 , in particular greater than 0.2 g / cm 3 , is built up ,
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Dichtegradient durch Verwendung mindestens zweier Pufferlösungen aufgebaut wird.12. The method according to claim 11, characterized in that the density gradient is built up by using at least two buffer solutions.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Pufferlösungen um mindestens eine Komponente aus der Gruppe Glycerin, Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat, Cäsiumbro- mid, Natriumbromid, Kaliumbromid und/oder Saccharose handelt.13. The method according to claim 12, characterized in that the buffer solutions consist of at least one component the group glycerol, cesium chloride, cesium sulfate, cesium bromide, sodium bromide, potassium bromide and / or sucrose.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass während des Gießvorgangs über noch auszupoly- merisierende Gele kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren zugegeben werden.14. The method according to any one of claims 9 to 13, characterized in that polymerization initiators are continuously added during the casting process via gels still to be polymerized.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der Polymerisationsinitiatoren mittels computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten, erfolgt.15. The method according to claim 14, characterized in that the addition of the polymerization initiators is carried out by means of computer-controlled applicators, in particular burettes.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass während des Gießvorgangs über noch auszupoly- merisierende Gele zu applizierende Pufferlösungen und die Gele selbst gekühlt werden und anschließend die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion kontrolliert erhöht wird und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren verwendet werden.16. The method according to any one of claims 9 to 15, characterized in that buffer solutions to be applied and gels themselves are cooled during the casting process via gels still to be polymerized and then the temperature is increased in a controlled manner to start the polymerization reaction and / or after mixing the Gradient-activatable polymerization initiators can be used.
17. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Analyten, insbesondere Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass immobilisierte pH-Gradienten nach einem der Ansprüche 9 bis 16 hergestellt werden.17. A method for the isoelectric focusing of analytes, in particular proteins, characterized in that immobilized pH gradients are produced according to one of claims 9 to 16.
18. ' Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine18. 'Method according to claim 17, characterized in that a
Hochspannung von mindestens 10.000 Volt, vorzugsweise mindestens 20.000 Volt, insbesondere mindestens 30.000 Volt, appli- ziert wird.High voltage of at least 10,000 volts, preferably at least 20,000 volts, in particular at least 30,000 volts, is applied.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten pH-Gradienten unter eine Ölschicht oder eine ähnlich elektrisch isolierende Schicht fokus- siert werden.19. The method according to any one of claims 17 or 18, characterized in that the immobilized pH gradient below one Oil layer or a similar electrically insulating layer can be focused.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten mittels 2D-PAGE aufgetrennt und anschließend detektiert werden.20. The method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that the analytes are separated by means of 2D-PAGE and then detected.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten mit mindestens zwei unterschiedlichen Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen, stabilen Isotopen, massendifferenten Reagenzien und/oder deren Gemischen markiert werden.21. The method according to any one of claims 17 to 20, characterized in that the analytes are labeled with at least two different radioisotopes, fluorescent dyes, stable isotopes, mass-different reagents and / or mixtures thereof.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten pH-Gradienten in sogenannte IPG-Streifen (immobilisierte pH-Gradienten-Streifen) geschnitten und die Analyten während einer Rehydratisierung in diese IPG- Streifen eingebracht werden.22. The method according to any one of claims 17 to 21, characterized in that the immobilized pH gradients are cut into so-called IPG strips (immobilized pH gradient strips) and the analytes are introduced into these IPG strips during rehydration.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Rehydratisierung bei einer Spannung < 1.250 Volt erfolgt.23. The method according to claim 22, characterized in that the rehydration takes place at a voltage <1,250 volts.
24. Ver ahren nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass nach Einbringung der Analyten und während der isoelektrischen Fokussierung die IPG-Streifen an beiden Enden über elektrisch leitende und Ionen aufnehmende Elemente mit entsprechenden Elektroden verbunden sind.24. The method according to claim 22 or 23, characterized in that after the introduction of the analytes and during the isoelectric focusing, the IPG strips are connected at both ends to corresponding electrodes via electrically conductive and ion-absorbing elements.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Elementen um Wasser enthaltende Filterpapierstreifen handelt. 25. The method according to claim 24, characterized in that the elements are filter paper strips containing water.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterpapierstreifen mit einer wässrigen, Chemikalien enthaltenden Lösung, getränkt sind.26. The method according to claim 25, characterized in that the filter paper strips are impregnated with an aqueous solution containing chemicals.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente während der isoelektrischen Fokussierung mindestens einmal ausgetauscht werden.27. The method according to any one of claims 24 to 26, characterized in that the elements are exchanged at least once during the isoelectric focusing.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur während der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird. 28. The method according to any one of claims 24 to 27, characterized in that the temperature is kept almost constant during the isoelectric focusing.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294930B (en) * 2007-04-27 2013-08-14 杨春 Integral immobilization pH gradient production method and application thereof
CN103884765A (en) * 2014-02-21 2014-06-25 杭州市农业科学研究院 Method for obtaining two-dimensional electrophoresis difference protein map of chili pepper anther

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468365A (en) * 1992-09-24 1995-11-21 Applied Biosystems, Inc. Viscous electrophoresis polymer medium and method
WO2000077506A1 (en) * 1999-06-09 2000-12-21 Proteosys Ag Reversibly fixed gels for gel electrophoresis
WO2002029396A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Protagen Ag Method and device for carrying out 2d electrophoresis in large gels
WO2002032591A2 (en) * 2000-10-19 2002-04-25 Picosep A/S A material useful for the separation of organic compounds, processes for its preparation and use of the material
WO2002070111A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Syddansk Universitet Method for the manufacture of gradient gels and method for analysing biomolecules on ultra-long ipg gels
WO2002103345A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-27 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Improved gel for electrophoresis and uses thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468365A (en) * 1992-09-24 1995-11-21 Applied Biosystems, Inc. Viscous electrophoresis polymer medium and method
WO2000077506A1 (en) * 1999-06-09 2000-12-21 Proteosys Ag Reversibly fixed gels for gel electrophoresis
WO2002029396A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Protagen Ag Method and device for carrying out 2d electrophoresis in large gels
WO2002032591A2 (en) * 2000-10-19 2002-04-25 Picosep A/S A material useful for the separation of organic compounds, processes for its preparation and use of the material
WO2002070111A2 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Syddansk Universitet Method for the manufacture of gradient gels and method for analysing biomolecules on ultra-long ipg gels
WO2002103345A1 (en) * 2001-06-14 2002-12-27 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Improved gel for electrophoresis and uses thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294930B (en) * 2007-04-27 2013-08-14 杨春 Integral immobilization pH gradient production method and application thereof
CN103884765A (en) * 2014-02-21 2014-06-25 杭州市农业科学研究院 Method for obtaining two-dimensional electrophoresis difference protein map of chili pepper anther
CN103884765B (en) * 2014-02-21 2015-12-09 杭州市农业科学研究院 The acquisition methods of pepper anther dielectrophoresis differential protein collection of illustrative plates

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